用于RNA研究的样本如何准备呢?

时间:2016-11-30 10:56:19 点击: 【字体: 收藏

动物组织样本

快速活体中获取目的组织后,快速用RNase-free水清洗去除血渍和污物,吸干表面液体,并快速将样品分割成50100mg左右的小块液氮速冻后(除了保证RNA质量外,还要杜绝因环境的改变而导致的表达调控的变化),放入RNase-free的带螺纹旋盖的管中,-80℃低温保存,干冰运输。


组织样品离开活体后,建议在3min内进行液氮速冻,速冻前操作时间越长,RNA降解的可能性越大。


如果使用RNAlater®一类商业组织RNA保护试剂保存组织样品,请严格按照相应产品使用说明进行操作。尽量使组织块尺寸保持在5mm左右,过小或过大都不利于后续实验操作。


如果使用TRIzol裂解液保存送样,请务必先进行液氮研磨破碎,然后加入TRIzol中彻底研磨,小于100mg组织可加入1mLTRIzol裂解。组织样品切勿过量,常温裂解5min后,-80℃低温保存,干冰运输。


植物组织样本

取材新鲜组织,剪切成小块,立即用准备好的铝箔包裹组织,并在铝板上标记样本名称,在液氮中速冻之后转移至-80℃冰箱冻存或长期放置于液氮中,干冰运输。 


不建议使用RNAlater®一类组织RNA保护试剂保存植物组织样品。


不建议将植物组织样品溶于TRIzol®试剂中保存运输,TRIzol法并不适用于多糖多酚含量高的植物组织样品。


细胞样本
1
贴壁细胞

首先去除细胞培养上液,然后用1XPBS漂洗1~2次,彻底去除PBS溶液;


用足量的TRIzol对细胞进行裂解(一般10cm2的培养皿均匀铺满细胞需要1mL TRIzol),裂解过程中用移液器轻轻反复吹吸,如发现裂解液有明显粘丝现象,表示裂解不是很充分,可以适当增加裂解液的用量,最终应为裂解液澄清,没有细胞碎片团块。然后将细胞裂解液转移到1.5mLEP管中,室温静置继续裂解5min后,转移至-80℃冰箱长期保存。参考用量为每5×10^6个细胞加1mL TRIzol


2
悬浮细胞 

离心收集细胞,然后用1xPBS漂洗1~2次,彻底去除PBS溶液。注意细胞离心收集速度要适度,一般样本3,000rpm离心5min即可。不要使细胞离心过实而造成裂解液不能充分渗透,转数过高还会导致细胞破裂,RNA降解。再用充足量TRIzol对细胞进行裂解(方法同2.3.1贴壁细胞处理)。裂解在TRIzol中的样品,短期保存于-20℃冰箱中(1周内),如长期保存可转移至-80℃冰箱。参考用量为每1×10^6个细胞加1mL TRIzol。


也可离心收集细胞后直接液氮速冻后,转移至-80℃低温长期保存,干冰运输。


血液样本

用于提取Total RNA的血液,强烈建议使用血液保护剂送样或分离白细胞后送样。常规的EDTA抗凝管收集的全血不太适合用于RNA的研究


推荐使用BD PAXgene blood tube保存(伯豪生物可有偿提供该型号收集管)。PAXgene®血液RNA管内含稳定体内基因转录性状的添加剂,它是通过减少体外RNA降解并将基因诱导减少到最小而发挥作用的。


血浆样本

取出血液样本,1,600g,4℃离心10min。离心后血液分为三层,上层的是血浆,中间的是白细胞层,下层的是红细胞层,用移液器吸取血浆至冻存管中。如图所示。

a.png

离心后采血管内血液分层情况示意图


血清样本

血清,指血液凝固后,在血浆中除去纤维蛋白原分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋原白已被除去的血浆。如图所示。

b.png血清示意图


为使血液完全凝固,将收集管室温(15-25℃)静置10min至1h。若收集管中有促凝血剂,则凝血时间为10min。若未加促凝血剂,凝血时间至少为30min。


1,600g,4℃离心10min。

小心转移上层血清层至新的离心管。16,000g,4℃离心10min。

小心转移澄清的上清液,冻存于-80℃冰箱备用,干冰运输。


 菌体 

 采用离心或其他方法分离菌和培养基。


收集菌至15mL离心管中,3,000rpm,4℃离心后弃上清,用1.0mL PBS(或其他符合要求的缓冲液)溶液洗三遍。弃上清保留沉淀。液氮速冻后,-80℃冰箱保存,干冰运输。


石蜡包埋样本 

至少提供10片以上10μm厚度的切片或者提供包埋的蜡块。切取石蜡时,如果标本暴露空气中,弃去最初的2-3片,切片完成后尽量选取切片中组织含量高的部分,如果石蜡过多可切去石蜡部分。如果需要再从切片上剥离特定区域的组织(如肿瘤),除了提供白片之外,还需要提供HE染色的片子,并在HE片子上圈出特定区域。


RNA 

小伙伴需提供NanoDrop®、Qubit或Agilent 2100中的一种形式的样本分析结果:请仔细纯化样品,尽量避免多糖、蛋白质和外切酶的残留,样本必需注明溶剂成分。


单细胞样本
1
基于流式细胞术对单细胞的分选

流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤:①取材:取手术或活检组织必须具有代表性,如取手术肿瘤组织,必须取瘤细胞生长旺盛部位;组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜;一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存;②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色;③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储;④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析;⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。


2
物理方法分离单细胞

光学显微镜下通过毛细管虹吸的方法获得单细胞,直接将毛细管折断后裂解在特定介质中,-80℃冰箱保存,干冰运输。物理方法分离单细胞对硬件和操作的熟练程度要求较高。


3
Fluidigm C1分离单细胞

Fluidigm基于其专利的微流体技术开发了一种全新的单细胞基因表达检测方法,可以快速可靠地分离、处理、对单一细胞的基因组进行分析。仪器、芯片、试剂、软件、试剂盒整合的系统可以自动完成从细胞捕获、裂解、逆转录、预扩增,到最终检测和分析细胞活动的全部流程。Fluidigm新推出的C1单细胞自动制备系统和已在单细胞基因表达分析中广泛被采用的BioMark™ HD微流体PCR系统组成。C1单细胞自动制备系统可以同时捕获96个的细胞,在同一张芯片上完成细胞捕获、裂解、逆转录及预扩增的全过程。


4
单细胞样本的送样要求

单个细胞或小于1000个细胞,细胞分离后加到 8µL 不含Mg2+和Ca2+的1×PBS溶液中,立刻加入裂解液,并按照操作说明进行操作,操作后-80℃或液氮度速冻,干冰运输。若是培养的大量细胞,可以先用不含Mg2+和Ca2+的1×PBS溶液清洗细胞后再加到 8µL 不含Mg2+和Ca2+的1×PBS溶液中,立刻加入裂解液,并按操作说明进行操作,-80℃或液氮速冻,干冰运输。


外泌体

外泌体是包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体,且外泌体天然存在于体液中,包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。