伯豪客户《EMBO reports》上阐述circRNA在膀胱癌中的作用机制

时间:2017-10-10 15:43:14 点击: 【字体: 收藏

研究背景

        膀胱癌(Bladder cancer)是一种常见的泌尿系统肿瘤,由于易转移,死亡率高,5年生存率只有8.1%。因此,研究膀胱癌的发病机制,有助于对膀胱癌的诊断和治疗。circRNA是一类具有闭合环形结构的非编码RNA,是现阶段转录组学研究的新星。本研究circRNA的角度出发,深入阐述了一个circRNA在膀胱癌中的作用机制。

研究思路



研究结果

1. 膀胱癌特异性circRNA的筛选与鉴定

        为筛选和膀胱癌特异性相关的circRNA,研究人员对3对配对癌组织和正常膀胱组织进行了circRNA特异性的高通量测序伯豪生物参与),共鉴定到16,353个circRNA。其中,有88.35.%的circRNA来源于exons,有524个在癌组织中下调,47个上调。

        接下来,研究人员在膀胱癌细胞系(T24T和UMUC3)中进行了RT-PCR验证,发现circHIPK3稳定地在两种细胞系中表达。进一步的分析和大样本鉴定表明,circHIPK3在79.5%的膀胱癌组织中特异性降低,并与grade, invasion和淋巴结转移相关。FISH实验表明,circHIPK3主要定位于细胞质中。


2. circHIPK3抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭

        为探究circHIPK3的生物学功能,研究人员在两个细胞系中过表达circHIPK3,进行细胞表型检测。结果显示,细胞迁移和侵袭受到抑制。当siRNA敲降circHIPK3时,细胞迁移和侵袭增强。因此,circHIPK3在膀胱癌细胞中影响了细胞的迁移和侵袭能力。


3. circHIPK3在膀胱癌细胞中大量吸附miR-558

        在第一篇circHIPK3的研究中,其就是通过miRNA sponge方式发挥功能。那么,在膀胱癌中,是否也是ceRNA方式呢?通过miRanda,PITA和RNAhybrid预测,发现有12个miRNA能与之结合。Pull down实验表明,miR-558能在T24T和UMUC3中与circHIPK3结合。进一步的突变实验也验证了两者的结合关系,FISH实验也验证了两者在细胞质中的共定位。因此,circHIPK3能直接结合miR-558。


4. miR-558通过靶向HPSE影响膀胱癌细胞的迁移,侵袭和血管生成

        先前的研究表明,miR-558在神经母细胞瘤中通过促进HPSE的转录,而影响迁移,侵袭和血管生成,而HPSE又在膀胱癌中高表达。因此,研究人员在膀胱癌组织和细胞系中对miR-558进行了验证,确实发现表达上调。然后,通过过表达实验,也发现膀胱癌细胞的迁移和侵袭增强。而抑制miR-558表达时,出现了相反的细胞表型。RT-PCR和Weston blot实验表明,HPSE,VEGF,MMP-9表达在过表达时增强,抑制表达时减弱。因此,miR-558通过靶向HPSE影响膀胱癌细胞的迁移,侵袭和血管生成。


5. 过表达circHIPK3逆转miR-558对细胞的影响

        circHIPK3和miR-558的结合关系搞清楚了,两者的生物学功能也是一致的,那么他们是不是通过这种关系在同一条路上起作用呢?结果显示,过表达circHIPK3,HPSE,VEGF,MMP-9表达显著降低,而当敲降circHIPK3时,都显著上调。那么是否是通过结合miR-558发挥功能呢?把miR-558 mimic和过表达circHIPK3共转染,可以发现HPSE,VEGF,MMP-9表达显著降低了,迁移和侵袭也降低。因此,circHIPK3确实是通过吸附miR-558,调控了HPSE的转录来影响细胞的迁移,侵袭和血管生成。


6. 小鼠模型实验验证circHIPK3的生物学功能

        体外细胞实验验证了功能,在体内是否work,这是一个问号。因此,研究人员将转染circHIPK3的T24T细胞移植到裸鼠中。结果显示,肿瘤的生长速率和质量比对照低。免疫组化实验显示,HPSE,VEGF,MMP-9表达受到抑制,CD31+,平均血管密度减少。另外,转移模型实验也明显显示,过表达circHIPK3的小鼠肺转移能力减弱。因此,小鼠实验也有效地验证了circHIPK3对膀胱癌生长,血管生成和转移的影响。


研究结论

        本研究通过高通量筛选,体内体外的功能验证实验,报道了一个已经有研究的circRNA在膀胱癌中的生物学功能。当然,在膀胱癌中,circHIPK3是第一次报道,也是通过了吸附和之前报道的不同的miRNA发挥功能。因此,做circRNA研究,无论是有过研究,还是没有研究过的,只要能把机制说清楚了,功能说明白了,都能在比较好的杂志上发表。

原文出处:Li Y, Zheng F, Xiao X, Xie F, Tao D, Huang C, Liu D, Wang M, Wang L, Zeng F, Jiang G. CircHIPK3 sponges miR-558 to suppress heparanase expression in bladder cancer cells. EMBO reports.2017.