宏基因组测序在食品微生物研究中的应用

时间:2017-01-10 13:22:07 点击: 【字体: 收藏

1. 食品微生物研究背景

食品是一个复杂的,动态的微生物生态系统,其中存在着大量的细菌,酵母菌和丝状真菌。这些微生物与食品的相互作用对食品的发酵,风味形成,以及食物的腐败变质产生重要的影响。因此研究食品中微生物的群落结构多样性以及基因功能多样性具有重要的意义。

2. 研究思路

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3. 研究方法

16S rDNA扩增子测序

通过选择特定通用引物,对16S rDNA特定区域进行PCR扩增,进而通过新一代测序技术对该区域进行测序,来分析环境或者临床样本中微生物的群落结构多样性。

基因组测序:

利用二代测序技术对样品中微生物的群体基因组进行测序,而解析微生物群体的物种多样性、进化关系、基因组成、功能多样性及微生物与环境/宿主之间的关系,为发掘和研究特定功能的新基因提供了便利。

样本要求

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1. 分析流程

图片2.png                  16S rDNA扩增子测序分析流程                               宏基因组测序分析流程

2. 分析结果展示

16S rDNA/18S rDNA/ITS扩增子测序分析结果示例

a) 样本间OTU分布和物种组成

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b) 微生物群落结构在不同样本组间是否存在差异(PCA, NMDS, PCoA和样本相似度树与柱状图组合分析)

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PCA                                                       NMDS                                                            PCoA


PCA运用方差分析,将多组数据的差异反映在二维坐标图上,坐标轴取能够最大反映方差值两个特征值。如果两个样品距离越近,则表示这两个样品的组成越相似。

NMDS非度量多维定标法常用于比对样本组之间的差异,可以基于进化关系或数量距离矩阵。图中点之间的距离越近,反映样本间组成越相似。

PCoA:是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法,通过PCoA 可以观察个体或群体间的差异。图中点之间的距离越近,反映样本间组成越相似。


c) 哪些物种在不同组间存在着差异LEfSe分析)

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LEfSeLinear discriminant analysis Effect Size线性判别分析是用于发现不同生物条件或环境下的两组或多组样本中最能解释组间差异的基因或功能特征。不同的区域表示不同分组,树枝中红色节点表示在红色组别中起到重要作用的微生物,绿色节点表示在绿色组别中起到重要作用的微生物类群,黄色节点表示的是在两组中均没有起到重要作用的微生物类群。

d) 哪些因素影响了物种的组成RDA/CCA分析)

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RDA/CCA分析主要用来反映菌群与环境因子之间的关系。RDA 是基于线性模型,CCA是基于单峰模型。分析可以检测环境因子、样品、菌群三者之间的关系或者两两之间的关系。环境因子之间的夹角为锐角时表示两个环境因子之间呈正相关关系,钝角时呈负相关关系。环境因子的射线越长,说明该影响因子的影响程度越大;备注:需要客户提供环境因子数据

宏基因组分析结果示例

a) 物种注释和丰度信息

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A、 相对丰度前20个的物种在样本间的热图B从内向外,依次为界、门、纲、目(order)、科(family)、属(genus)、种(species)和菌株(strain)。

b) COG注释和KEGG注释

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               基因集的COG注释                                      基因集KEGG注释

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KEGG通路信息

 

c) 组间LefSe差异判别分析

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1. 案例解析

案例1宏基因组测序研究发酵乳开菲尔的微生物组成和风味生成

目的通过16S rDNA/ITS以及宏基因组测序来研究来自三个不同地域的开菲尔在发酵24h期间的微生物群落结构,基因功能以及风味变化。

分组:3个地区的谷粒(France,Ireland, the United Kingdom),3个发酵时间点(0h8h24h

方法:16S rDNA/ITS测序(分析细菌和真菌的多样性),宏基因组测序(分析基因功能以及物种组成)

结果:在发酵的早期,开菲尔基质乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)是主要的细菌种属,而到了发酵后期,肠系膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)成为了优势种属。该结果与功能基因分析结果一致:与芳香族氨基酸生物合成相关的基因在开菲尔基质乳杆菌中消失,而在肠系膜明串珠菌中存在。另外,微生物群落结构和代谢通路的变化与挥发性物质的变化是相对应的。比如,醋杆菌属与醋酸的合成相关,乳杆菌属与羧酸和酮类的合成相关最后,作者发现了与开菲尔中与益生菌功能相关的基因。

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Figure 1 不同地域开菲尔在不同发酵时间的物种组成和代谢通路分析

原文出处:Walsh A M, Crispie F, Kilcawley K, et al. Microbial Succession and Flavor Production in the Fermented Dairy Beverage Kefir[J]. mSystems, 2016, 1(5): e00052-16.

案例216S rDNA扩增子测序分析电加热处理和水浴处理后的猪肉细菌多样性研究

目的通过16S rDNA测序来研究电加热处理和水浴加热处理后的猪肉的细菌多样性为猪肉的保存提供理论依据

分组:2种处理方式(电加热处理和水浴加热处理)3贮存时间点(0d7d21d

方法:16S rDNA测序V4-V5

结果:睡着贮存时间的增长,两种处理方式下的猪肉的细菌多样性都在下降,但是,电加热处理后的细菌多样性相对于水浴加热处理要更丰富。贮存两周时,Bacillus, Pseudomonas, Enterococcus Lactococcus是最丰富的种属;在贮存末期时,最丰富的细菌种属为Carnobacterium。在电加热处理组中,Brevundimonas, Bacteroidaceae, Lactobacillaceae, 不可培养的Clostridiales Family_XIII, Alcaligenaceae Micrococcales 最丰富的种属而在水浴加热处理组中Moraxellaceae是最丰富的种属。作者推测造成两组之间产生细菌多样性差异的原因可能是细菌耐热机制的不同。

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左图不同处理方式下猪肉细菌在门和属水平下的相对丰度柱状图,(a)门水平,(b)属水平

右图:不同处理方式下,微生物的进化差异分布(a),以及线性回归分析(LDA)分析(b

原文出处:Tian X, Wu W, Yu Q, et al. Bacterial diversity analysis of pork longissimus lumborum following long term ohmic cooking and water bath cooking by amplicon sequencing of 16S rRNA gene[J]. Meat Science, 2017, 123: 97-104.