宏基因组测序在环境微生物研究中的应用

时间:2017-01-10 13:22:30 点击: 【字体: 收藏


1. 环境微生物研究背景

微生物是地球上分布最为广泛的类群,  它们存在于各种生境。每一升海水中,有大约上亿个细菌菌落,每克土壤中有上千万的细菌。其担负着环境生物降解,污染环境的修复和能量循环等重要职责。

2. 研究思路

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3. 研究方法

16S rDNA扩增子测序

通过选择特定通用引物,对16S rDNA特定区域进行PCR扩增,进而通过新一代测序技术对该区域进行测序,来分析环境或者临床样本中微生物的群落结构多样性。

基因组测序:

利用二代测序技术对样品中微生物的群体基因组进行测序,而解析微生物群体的物种多样性、进化关系、基因组成、功能多样性及微生物与环境/宿主之间的关系,为发掘和研究特定功能的新基因提供了便利。


4. 样本要求


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5. 分析流程

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  16S rDNA扩增子测序分析流程                      宏基因组测序分析流程

2. 分析结果展示

16S rDNA扩增子测序分析结果示例

a) 样本间OTU分布和物种组成

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b) 微生物群落结构在不同样本组间是否存在差异(PCA, NMDS, PCoA和样本相似度树与柱状图组合分析)

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                                          PCA                                   NMDS                                                  PCoA


c) 哪些物种在不同组间存在着差异LEfSe分析)

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LEfSeLinear discriminant analysis Effect Size)线性判别分析是用于发现不同生物条件或环境下的两组或多组样本中最能解释组间差异的基因或功能特征。不同的区域表示不同分组,树枝中红色节点表示在红色组别中起到重要作用的微生物,绿色节点表示在绿色组别中起到重要作用的微生物类群,黄色节点表示的是在两组中均没有起到重要作用的微生物类群。



d)哪些因素影响了物种的组成RDA/CCA分析)

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RDA/CCA分析主要用来反映菌群与环境因子之间的关系。RDA 是基于线性模型,CCA是基于单峰模型。分析可以检测环境因子、样品、菌群三者之间的关系或者两两之间的关系。环境因子之间的夹角为锐角时表示两个环境因子之间呈正相关关系,钝角时呈负相关关系。环境因子的射线越长,说明该影响因子的影响程度越大;备注:需要客户提供环境因子数据


宏基因组分析结果示例

a) 物种注释和丰度信息

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A、 相对丰度前20个的物种在样本间的热图;B从内向外,依次为界、门、纲、目(order)、科(family)、属(genus)、种(species)和菌株(strain)。

b) COG注释和KEGG注释

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               基因集的COG注释                                   基因集KEGG注释

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KEGG通路信息

 

c) 组间LefSe差异判别分析

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1. 案例解析

案例116S rDNA扩增子测序和宏基因组测序研究温泉中嗜热微生物的多样性

目的通过16S rDNA和宏基因组测序来研究温泉中嗜热微生物的群落结构和功能多样性。

样本温泉水和沉积物的混合物

方法:16S rDNA测序V3-V4区),宏基因组测序

结果 16S rDNA测序发现,在温泉水和沉积物样本中,共有超过35个门的微生物被鉴定。其中,厚壁菌门和变形菌门约占所有原核生物的57%。另外,大约有70%的嗜热微生物是严格厌氧菌。专性无机化能营养嗜热微生物-氢杆菌属是其中的代表种属。一些高温厌氧光合微生物和酸性嗜热微生物同样被检测到。以上也这结果中的大多数门类的微生物在宏基因组测序中也被鉴定出。作者通过宏基因组测序发现了温泉中与碳,硫和氮代谢相关的微生物群体的代谢多样性。由于自然环境(丰富的植被,高有机质含量,和浅流)和地理化学因素(广泛的温度和pH值范围内),该温泉拥有丰富多元化的群体系统,同时也形成了各个群落之间的共生关系。

 

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16S rDNA测序分析物种的群落结构

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KEGG代谢通路分析

原文出处:Chan C S, Chan K G, Tay Y L, et al. Diversity of thermophiles in a Malaysian hot spring determined using 16S rRNA and shotgun metagenome sequencing. Frontiers in microbiology, 2015, 6: 177.

案例2、宏基因组测序分析植物可以影响遗留污染土壤中微生物的群落结构和潜在功能 

目的在污染的土壤中,植物和微生物的相互作用扮演着重要的角色。本研究通过分析三种植物(辣根,龙葵和烟草)和NPK施肥是如何改善遗留污染土壤中的微生物的群落结构和功能的。

方法:16S rDNA测序和宏基因组测序

结果: 研究发现,所选的三种植物可以影响污染土壤中的微生物的群落结构,而施肥却不能。这种差异在植物的根际土壤中尤为显著。在比较根际和非根际土壤的中的微生物多样性时发现,根际土壤中的α变形菌、β变形菌、γ变形菌以及拟杆菌的含量要比非根际高,而这些微生物通常被认为是生存在营养丰富的环境中。这个结果也与生长快,喜欢营养丰富环境这一类微生物的特性相符合。功能分析发现,与信号转到,防御机制,氨基酸转运和代谢在不同的处理间有显著差异。结果表明,在污染的土壤中,植物和微生物的相互作用可能可以用来进行污染修复。

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16S rDNAA)和宏基因组(B)测序鉴定样本群落结构

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Heatmap图分析各样本之间的功能差异COG注释)

原文出处:Ridl J, Kolar M, Strejcek M, et al. Plants rather than mineral fertilization shape microbial community structure and functional potential in legacy contaminated soil. Frontiers in Microbiology, 2016, 7.