伯豪生物Fluidigm Biomark™ HD SNP分型解决方案

时间:2016-12-19 09:21:22 点击: 【字体: 收藏

一、 概述

      单核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphisms,SNPs)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP作为一种常见的遗传标记,可用于遗传疾病基因的连锁定位、克隆和鉴定;复杂疾病的关联分析;肿瘤易感基因和热点突变的鉴定;精准医疗;种群进化、迁徙等研究方面有着重要作用。

      对于SNP分型方法有很多,高通量的方法有测序芯片等;中低通量的方法有定量PCR、引物延伸、溶解曲线等。本项目推荐采用Fluidigm公司的Biomark™ HD 系统进行SNP分型检测。Fluidigm高通量基因分析系统(Bio-Mark™),是集成了流体通路(Integrated Fluidic Circuit,IFC)技术、实时定量PCR技术及强大的基因分析软件的技术平台。IFC 将微流控通道、阀门和反应仓集成在一张芯片上,通过一个控制系统自动完成多达9216个PCR反应。大大降低了手工加样的步骤并减小了误差。IFC系统比传统的384孔板系统能少用99.5%的master mix 试剂却多产生出24倍的数据。


二、 Fluidigm SNPs的检测方法介绍

1. Fluidigm技术特点:

      Biomark™ HD系统的核心技术就在于将实时定量技术集成了流体通路技术:利用集成电路制作工艺(光刻)在硅片或石英玻璃上刻有许多微管和微腔体,通过不同的控制阀门控制溶液在其中的流动来实现生物样品的分液、混合,并实现高效准确地实时PCR扩增、检测。


图1Biomark™ HD系统


      Biomark™ HD系统配套的检测芯片有如下几种格式,满足不同SNP位点和样本数的研究需求,分别为12*12(12样本*12位点),48*48(48样本*48位点),96*96(96样本*96位点),192*24(192样本*24位点),不同格式检测芯片如图2。


图2不同格式检测芯片图示


      Fluidigm的SNP检测技术与Taqman类似是基于终端荧光读取判断,每孔采用双色荧光检测一个样本的一个位点可能的两种基因型,不同的SNP模板对应不同的荧光产物。

      (1) 准确度:Juno平台的实验原理与Taqman一样,是基于实时定量PCR的技术手段,基因分型的准确率>99%。[1]

      (2) 特异性Taqman探针,一般选用8-12bp长度在SNP位点两端设计,可能导致多个同源序列扩增,引起背景增高,杂交信号降低,KASP的引物为24-26bp,特异性更高,SNP call rate 会更高,达到99.9%。

      (3) 成本低:纳升级的反应体系十分节省试剂;对于每一个特定位点单独合成的探针,KASP的非荧光标记的引物,保质期长,而Taqman的针对特定位点的探针是荧光标记的,保质期短,成本高,用不掉会浪费。而KASP荧光标记的Master mix为通用型消耗品,可根据实验用量酌情采购,不会浪费。

      (4) 通量高:一次芯片最多可进行9216个反应。

      (5) 灵活性:选择已有芯片或定制新芯片。任何种属的相应序列,经过预扩增验证后设计探针,有效提高低质量、低浓度或珍贵样本的分析结果。


2. SNP 检测样品要求:

      对于人类基因组,建议最少10μl,浓度60ng/μl。对于大于人类基因组的其它物种的基因组,建议使用specific target amplification(STA)。


3. 实验流程:


      上样到拿到数据只需要3-4小时左右。


三、 常见SNP分型方法概述以及与Biomark HD平台比较

1. 一代测序(sanger sequencing)

优点:SNP分析金标准,既能发现已知SNP,也能发现未知SNP。

缺点:每个位点均需要经PCR扩增、跑胶,然后切胶纯化,再测序。流程相对复杂,成本较高,工作量大,周期长,不适合大样本多位点检测。同时,一代测序仅能检测频率高于20%的SNP位点。

2. SNaPshot

优势:类似LDR等多重引物单碱基延伸技术,可同时进行约10个位点PCR产物引物延伸,适合中低通量的SNP分型。

劣势:操作复杂,每个样品的每个位点都需要PCR预先扩增,跑胶,DNA纯化。对延伸引物要求极高,如每个引物有4-6个碱基差异,不能有互补区段,还要相同条件延伸,除厂家已经验证的少数位点外,很难自己设计针对新位点的检测。步骤分散,费时且易出错,准确性不高。

3. 焦磷酸测序(pyrosequencing)

优势:相对于SNaPshot,通量进一步增大,可以分析96个样本的SNP,不需要制胶,不需要毛细管电泳,也不需要荧光染料和同位素。分析简单,结果直观。

劣势:价格昂贵。

4. Taqman探针技术

优势:金标准,准确度高,适合样本多、位点数量少的检测。

劣势:价格昂贵(探针合成费用高),仅检测已知SNP位点,通量小,一般为少数几个位点适用,对于样本的质量要求较高,除了样本无降解外,还需要浓度尽可能的一致,这样结果才会比较集中。

5. Microarray芯片法

优势:高通量,适用于全基因组SNP扫描,适用于少样本、大量SNP位点筛查;

劣势: 准确度偏低,需要用测序或Taqman探针法进行验证;只能识别已知SNP位点;不适宜多样本、中低SNP位点的检测;价格昂贵。

6. Sequenom MassARRAY

优势:成本较低,不需要合成特殊的荧光引物,只需要一对PCR引物以及延伸引物即可;检测方便,灵敏度高,数据准确性有保证。

劣势:对于SNP位点两侧序列要求较高,存在特殊序列,如SNP位点,插入缺失等会影响准确性。另外,对于样本质量稍微有些高,后期补数据较为麻烦,如果样本质量不是很好的,建议谨慎选用;单次反应可检测的SNP位点在20-40之间,超过这个数量的位点需要分布在不同的Panel中,增加了成本。

Fluidigm与SNP分型的金标准Taqman的数据具有高度的一致性,在高质量的DNA条件下,能达到99.9%的检出率和99.75%的准确度。



      综上所述:中低通量SNP验证研究(几百~几千样本中,检测几十个SNP位点)选择Fluidigm平台进行检测,在单个SNP位点成本、检测周期,相对于其它检测平台都具有明显的优势。同时,检测灵敏度和准确率与金标准的Taqman具有高度一致性。


服务优势:

  • 高通量,成本低:上千样本,几十至数百SNP位点,都可以检测,样本量和位点数越高,每个样本的每个位点检测成本越低。

  • 灵敏度高:位点特异性探针,荧光标记的延伸引物,与Taqman金标准吻合度高。

  • 时间短:从样本处理到拿到数据3-4个小时。

  • 灵活性:任意物种,只要知道目的序列,的探针可以定制。


五、 Fluidigm SNP 分型应用范围

  • 人类基因组研究和药物基因组学研究

  • 分子标记辅助育种和家畜遗传标记追踪

  • 商业化转基因作物的检测和定量

  • 分子标记筛选优良性状的农作物

  • 渔业管理和野生动物种类的遗传标记的追踪

  • 生物技术服务实验室的遗传鉴定和质控